|
|
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny.
Darebná, Petra ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny Petra Darebná (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Láčkovky (Nepenthes), vyskytující se převážně na Borneu a Sumatře, jsou jedny z mála masožravých rostlin produkujících si své vlastní proteolytické enzymy (nepenthesin I a nepenthesin II), zajišťující rostlině náhradní zdroj dusíku a dalších živin v případě růstu na půdách tyto živiny postrádajících. Tyto aspartátové proteázy jsou schopné proteolýzy při nízkém pH, které je ustaveno v trávicí láčkové tekutině po odchytu hmyzu a ve spolupráci s dalšími proteiny se účastní digesce kořisti. Předkládaná práce se zabývá zpracováním trávicí tekutiny, izolované z láček masožravých rostlin rodu Nepenthes a jejím možným použitím jako nástroje při studiu proteinů pomocí vodík/deuteriové výměny. Izoláty trávicích tekutin byly očištěny od hrubých nečistot centrifugací, aktivovány okyselením a ultrafiltračně koncentrovány. U získaných preparátů byl sledován obsah proteinů, jejich proteinový profil a byla u nich enzymatickou esejí stanovena aktivita kyselých proteáz. Následně byly u preparátů na modelových proteinech pomocí hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií studovány preference štěpení za podmínek vhodných pro experimenty...
|
|
|
Příprava a využití kyselých proteáz pro štěpení proteinů v experimentech H/D výměny.
Kukla, Jan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
- 4 - Abstrakt Vodík/deuteriová výměna ve spojení s hmotnostní spektrometrií (HX-MS) využívá spontánní výměny amidických vodíků proteinové páteře za atomy deuteria z roztoku k získání informace o změnách v proteinové struktuře. Pro lokalizaci těchto změn na konkrétní oblasti proteinu je nejčastěji využívána enzymatická digesce zkoumaných proteinů aspartátovými proteasami. Schopnost proteas produkovat malé překrývající se peptidy, které dostatečně pokrývají celou proteinovou sekvenci, je zásadní pro lokalizaci konkrétních oblastí, které nás v proteinu zajímají. V této práci byly připraveny rekombinantní proteasy nepenthesin I (z Nepenthes gracilis) a rhizopuspepsin (z Rrizopus chinensis) a byly srovnány s komerčně dostupnými proteasami prasečím pepsinem A a aspergillopepsinem (z Aspergillus saitoi). Porovnání bylo provedeno aktivitními testy, kdy byl zkoumán vliv pH, teploty a denaturačních a redukčních činidel na stabilitu a ktivitu proteas v roztoku. Všechny čtyři proteasy byly imobilizovány na polymerní nosič POROS a jejich aktivita v online HX-MS uspořádání byla testována štěpením myoglobinu jako modelového substrátu.
|
|
|
Analysis of Histone Deacetylase 6/Kinesin Interactions
Nedvědová, Jana ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Intracelulární transport je zajišťován dvěma typy molekulárních motorů, kinesiny a dyneiny. Kinesin-1 zprostředkovává transport molekul and organel podél mikrotubulů směrem k jejich plus konci. Specifické protein-proteinové interakce jsou nezbytné k aktivaci kinesinu, protože volný kinesin je autoinhibován. Aktivace kinesinu je spojena se změnou jeho konformace. Aktivovaný kinesin se váže na mikrotubuly a za hydrolýzy ATP přenáší navázané molekuly a organely. HDAC6 je multifunkční protein složený z několika domén. Je důležitým regulačním faktorem v mnoha procesech týkajících se mikrotubulů. HDAC6 je totiž hlavním enzymem deacetylujícím mikrotubuly. Bylo popsáno, že inaktivace HDAC6 ovlivňuje transport na mikrotubulech, nicméně mechanismus těchto změn není znám. Inaktivace HDAC6 může tyto změny působit kvůli posttranslační modifikaci mikrotubulů nebo přímou interakcí s molekulárními motory. Tato diplomová práce je zaměřena na charakterizaci dosud nepopsané interakce mezi kinesinem-1 a HDAC6. Za tímto účelem byla provedena exprese a purifikace navržených konstruktů obou proteinů. Tyto konstrukty byly analyzovány pomocí mikroskopické termoforézy (MST) pro stanovení jejich vzájemné afinity a vodík-deuteriové výměny (HDX), kterou byly interakce popsány ze strukturního hlediska. Podle MST je afinita mezi...
|
|
|
Rekombinantní expresse chloridového kanálu z E. coli a jeho strukturní charakterizace
Hausner, Jiří ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Vrbacký, Marek (oponent)
Proteinová rodina chloridových kanálů zastává významnou funkci pro fyziologické pochody v organismu. Mechanismus jejich působení však ještě nebyl zcela vyřešen. Poškození, či mutace těchto proteinů vyvolávají závažná onemocnění, k jejichž léčbě by mohlo pomoci právě popsání transportních mechanismů těchto kanálů. Jelikož se savčí chloridové kanály obtížně produkují, jsou experimenty prováděny na prokaryotických variantách, jejichž struktura je známa a produkují se s vysokým výtěžkem. Většina experimentů je dnes prováděna staticky pomocí krystalografie. V této práci jsme se zaměřili na studium strukturních změn chloridového kanálu z E. coli pomocí vodík/deuteriové výměny. Tato metoda umožňuje dynamicky sledovat změny konformace proteinu v závislosti na pH a navázaných iontech. Experimenty byly prováděny za protonovaného (pH 4,5) a deprotonovaného stavu (pH 7,5) a za přítomnosti rozličných aniontů: Cl− , SCN− , I− , F− , TAR.(tartarový aniont). Data, která jsme získali, potvrzují některé teorie ohledně funkce chloridového kanálu jako Cl− /H+ antiporteru a přinášejí i nové poznatky. Předmětová slova biochemie, struktura proteinů, vodík/deuteriová výměna, hmotnostní spektrometrie Klíčová slova chloridový kanál, hmotnostní spektrometrie, vodík/deuteriová výměna, rekombinantní exprese, purifikace proteinů,
|
|
|
Příprava a využití kyselých proteáz pro štěpení proteinů v experimentech H/D výměny.
Kukla, Jan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
- 4 - Abstrakt Vodík/deuteriová výměna ve spojení s hmotnostní spektrometrií (HX-MS) využívá spontánní výměny amidických vodíků proteinové páteře za atomy deuteria z roztoku k získání informace o změnách v proteinové struktuře. Pro lokalizaci těchto změn na konkrétní oblasti proteinu je nejčastěji využívána enzymatická digesce zkoumaných proteinů aspartátovými proteasami. Schopnost proteas produkovat malé překrývající se peptidy, které dostatečně pokrývají celou proteinovou sekvenci, je zásadní pro lokalizaci konkrétních oblastí, které nás v proteinu zajímají. V této práci byly připraveny rekombinantní proteasy nepenthesin I (z Nepenthes gracilis) a rhizopuspepsin (z Rrizopus chinensis) a byly srovnány s komerčně dostupnými proteasami prasečím pepsinem A a aspergillopepsinem (z Aspergillus saitoi). Porovnání bylo provedeno aktivitními testy, kdy byl zkoumán vliv pH, teploty a denaturačních a redukčních činidel na stabilitu a ktivitu proteas v roztoku. Všechny čtyři proteasy byly imobilizovány na polymerní nosič POROS a jejich aktivita v online HX-MS uspořádání byla testována štěpením myoglobinu jako modelového substrátu.
|
|
|
Studium interakce mezi DNA a transkripčními faktory pomocí hmotnostní spektrometrie.
Slavata, Lukáš ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Transkripční faktory hrají v rámci buňky i celého mnohobuněčného organismu zásadní regulační úlohu. Důležitým faktorem, je jejich schopnost interagovat s ostatními regulačními proteiny a DNA. Přesto, že rozsáhlá část této interakční sítě je již zmapována, detailních informací o struktuře a dynamice protein-proteinových a protein-DNA komplexů je dosud velmi málo. V této práci jsme se zaměřili na možnosti studia konformačních změn daných tvorbou komplexu transkripčního faktoru s DNA pomocí strukturních metod hmotnostní spektrometrie: vodík/deuteriové výměny a chemického sítění. Jako modelový transkripční faktor jsme vybrali FOXO4, jehož DNA vazebná doména je strukturně dobře charakterizovaná jak ve volné formě, tak v komplexu s DNA (In Czech).
|
|
|
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny.
Darebná, Petra ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny Petra Darebná (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Láčkovky (Nepenthes), vyskytující se převážně na Borneu a Sumatře, jsou jedny z mála masožravých rostlin produkujících si své vlastní proteolytické enzymy (nepenthesin I a nepenthesin II), zajišťující rostlině náhradní zdroj dusíku a dalších živin v případě růstu na půdách tyto živiny postrádajících. Tyto aspartátové proteázy jsou schopné proteolýzy při nízkém pH, které je ustaveno v trávicí láčkové tekutině po odchytu hmyzu a ve spolupráci s dalšími proteiny se účastní digesce kořisti. Předkládaná práce se zabývá zpracováním trávicí tekutiny, izolované z láček masožravých rostlin rodu Nepenthes a jejím možným použitím jako nástroje při studiu proteinů pomocí vodík/deuteriové výměny. Izoláty trávicích tekutin byly očištěny od hrubých nečistot centrifugací, aktivovány okyselením a ultrafiltračně koncentrovány. U získaných preparátů byl sledován obsah proteinů, jejich proteinový profil a byla u nich enzymatickou esejí stanovena aktivita kyselých proteáz. Následně byly u preparátů na modelových proteinech pomocí hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií studovány preference štěpení za podmínek vhodných pro experimenty...
|
host ::
RSS.